Зоонозный пенистый вирус обезьян в Бангладеш отражает различные модели передачи и коинфекции

Полная статья Рисунки и данные Ссылки Цитаты Метрики Лицензирование Отпечатки и разрешения PDF РезюмеПенистые вирусы Симиана (SFV) широко распространены среди нечеловеческих приматов (NHP). Как и во всех ретровирусах, обратная транскрипция SFV приводит к рекомбинации и мутации. Поскольку было показано, что больше людей инфицировано SFV, чем любым другим вирусом, передаваемым обезьянами, SFV является потенциально мощной моделью для изучения вирусологии и эпидемиологии вирусов на стыке человека / NHP. В Азии SFV, вероятно, передается людям через укусы и царапины макак, которые возникают в повседневной жизни. Мы проанализировали несколько провирусных последовательностей из гена gag SFV как у людей, так и у макак, чтобы охарактеризовать ретровирусную передачу на интерфейсе человек / NHP в Бангладеш. Здесь мы приводим доказательства того, что люди могут одновременно инфицироваться несколькими штаммами SFV, причем некоторые люди инфицированы как автохтонным штаммом SFV, так и штаммом, аналогичным SFV, обнаруженным у макак из другой географической области. Эти данные в сочетании с предыдущими результатами позволяют предположить, что как перемещение макак при содействии человека, ведущее к появлению нерезидентных штаммов SFV, так и рекомбинация ретровирусов у макак вносят свой вклад в разнообразие SFV среди людей в Бангладеш. передача Введение Пенистые вирусы (ПП) представляют собой подсемейство ретровирусов, которые широко распространены у позвоночных-хозяев, включая нечеловеческих приматов, кошек, коров и лошадей. Clin Microbiol Rev2001; 14: 165–176. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] FV - это древние экзогенные вирусы, которые эффективно передаются между хозяевами, но, как известно, не вызывают заболевания. 2Свитцер В.М., Салеми М., Шанмугам Вет и др. Древнее совместное видообразование обезьян пенистые вирусы и приматы. Nature2005; 434: 376–380. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Хотя обезьяний пенистый вирус (SFV) почти повсеместно встречается у нечеловеческих приматов, он не является эндемическим для Homo sapiens. Зоонозная инфекция человека SFV ранее была обнаружена в нескольких странах и в различных контекстах межвидовых контактов, включая сотрудников лабораторий NHP и зоопарков в Северной Америке, работников «обезьяньего храма», владельцев домашних животных и людей, живущих вокруг макак на свободном выгуле на юге и юго-востоке страны. Азия и охотники на диких животных в Центральной Африке. 3Гессейн А., Руа Р., Бетсем Э, Турпин Дж., Махье Р. HTLV-3/4 и пенистые ретровирусы обезьян у человека: открытие, эпидемиология, межвидовая передача и молекулярная вирусология. Virology2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar] На сегодняшний день передача SFV от человека к человеку зарегистрирована у более чем 100 человек, что намного превышает количество случаев межвидовой передачи других известных ретровирусов, переносимых NHP: вирус иммунодефицита обезьян. обезьяньего ретровируса D или обезьяньего Т-клеточного лимфотрофного вируса.3Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/4 и пенистые ретровирусы обезьян у человека: открытие, эпидемиология, межвидовая передача и молекулярная вирусология . Virology2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar], 4Khabbaz RF, Heneine W, George JRet al. Заражение сотрудника лаборатории вирусом обезьяньего иммунодефицита. N Engl J Med1994; 330: 172–177. [Crossref], [Google Scholar], 5Lerche NW, Switzer WM, Yee JLet al. Доказательства инфекции обезьяньим ретровирусом типа D у лиц, профессионально контактировавших с нечеловеческими приматами. Дж. Вирол, 2001; 75: 1783–1789. [Crossref], [Google Scholar], 6Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam Vet al. Частое заражение обезьяньим пенистым вирусом у лиц, профессионально контактирующих с нечеловеческими приматами. Дж. Вирол, 2004; 78: 2780–2789. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar], 7Kalish ML, Wolfe ND, Ndongmo CB и др. Охотники из Центральной Африки, подвергшиеся воздействию вируса обезьяньего иммунодефицита. Emerg Infect Dis2005; 11: 1928–1930. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Учитывая высокую распространенность SFV в NHP, а также разнообразие и степень взаимодействия между людьми и NHP, по оценкам, количество инфицированных в мире может достигать десятков тысяч .8 Энгель Дж., Хангерфорд Л.Л., Джонс-Энгель Лет и др. Оценка риска: модель для прогнозирования межвидовой передачи обезьяньего пенистого вируса от макак (М. fascicularis) людям в обезьяньем храме на Бали, Индонезия. Am J Primatol 2006; 68: 934–948. [Crossref], [Google Scholar], 9Switzer WM, Shaohua T., Ahuka-Mundeke Set al.Novel, инфицирование обезьяньим пенистым вирусом от нескольких видов обезьян у женщин из Демократической Республики Конго. Ретровирология 2012; 9: 100. [Crossref], [Google Scholar] Кроме того, несколько продольных исследований людей, инфицированных SFV, показывают, что SFV не передается от одного человека к другому.10Boneva RS, Switzer WM, Spira TJet al. Клиническая и вирусологическая характеристика стойкой инфекции человека обезьяной пенистые вирусы. Ретровирусы AIDS Res Hum 2007; 23: 1330–1337. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Таким образом, характеристика факторов, влияющих на зоонозную передачу SFV, может обеспечить лучшую современную модель для понимания того, как и почему некоторые вирусы NHP способны вызывать устойчивую передачу вируса от человека к человеку. -Человеческая передача. Наша группа изучала взаимодействие между людьми и NHP в Бангладеш за последние 6 лет, уделяя особое внимание передаче инфекционных агентов между видами. 11 Оберсте М.С., Фероз М.М., Махер Кет и др. Характеризуя пикорнавирусный ландшафт среди синантропных нечеловеческих приматов. в Бангладеш, 2007–2008 годы. J. Virol, 2013; 87: 558–571. [Crossref], [Google Scholar], 12Oberste MS, Feeroz MM, Maher Ket al. Пикорнавирусные инфекции, полученные естественным путем у нечеловеческих приматов в зоопарке Дакки. Дж. Вирол, 2013; 87: 572–580. [Crossref], [Google Scholar], 13Karlsson EA, Engel GA, Feeroz MM и др. Инфекция вирусом гриппа у нечеловеческих приматов. Emerg Infect Dis2012; 18: 1672–1675. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Бангладеш - одна из самых густонаселенных стран мира, многие городские районы расположены в пределах или вблизи мест обитания NHP. Несколько таксонов NHP являются местными для Бангладеш, причем макака-резус (Macaca mulatta) является наиболее многочисленной и широко распространенной. 14 Хасан К., Азиз М.А., Алам С.М. и др. Распространение макак-резусов (Macaca mulatta) в Бангладеш: межпопуляционные различия в группах размер и состав. Предстоятель Консерватории, 2013; 26: 115–124. [Crossref], [Google Scholar] По мере того как лесная среда обитания продолжает сокращаться, небольшой экологически гибкий резус процветает в измененных человеком средах обитания, особенно в районах, где культурные традиции поощряют их терпимость.15 Фироз М.М., Соливен К., Смолл К.Э. и др. Динамика численности населения. макак-резус и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Хотя контакт между людьми и макаками-резус происходит в основном в сообществах, где макаки находятся на свободном выгуле, он также происходит в религиозных святынях, которые стали убежищами для макак, и из-за того, что макаки являются домашними животными. Кроме того, кочевой народ, известный как Баде или Каландар, веками путешествовал по региону, зарабатывая себе на жизнь постановкой представлений с обученными макаками. В отличие от Африки, охота на обезьян ради мяса диких животных в Бангладеш встречается редко, поскольку она ограничивается коренными народами в районах Читтагонгского горного района, граничащих с Мьянмой.16Chowdhury MSH, Halim M, Miah Met al. племя Мро в Читтагонгском горном районе, Бангладеш. Int J Biodiversity Sci Manage 2007; 3: 56–62. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Считается, что передача SFV от человека к человеку происходит чаще всего через укусы. SFV активно реплицируется в слизистой оболочке полости рта инфицированных обезьян, достигая высоких концентраций в слюне, где можно легко обнаружить геномные и мРНК.17Murray SM, Picker LJ, Axthelm MK, Linial ML Расширенные тканевые мишени для пенистой репликации вируса с вирусом иммунодефицита обезьян. индуцированная иммуносупрессия. Дж. Вирол, 2006; 80: 663–670. [Crossref], [Google Scholar] Однако относительно мало известно о том, как характеристики хозяина или вируса влияют на передачу SFV. Даже сильные укусы не всегда приводят к инфицированию. 9Switzer WM, Shaohua T., Ahuka-Mundeke Set al. Новые обезьяньи пенистые вирусные инфекции от нескольких видов обезьян у женщин из Демократической Республики Конго. Ретровирология 2012; 9: 100. [Crossref], [Google Scholar] И наоборот, некоторые люди с задокументированной инфекцией не помнят значительного контакта с тканями NHP или NHP. Другие важные вопросы, касающиеся передачи и заражения зоонозами SFV, остаются нерешенными. Например, хотя провирусная ДНК постоянно обнаруживается в течение десятилетий у некоторых людей, инфицированных SFV; у других людей вырабатываются антитела к SFV без детектируемой провирусной ДНК.3Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/4 и пенистые ретровирусы обезьян у людей: открытие, эпидемиология, межвидовая передача и молекулярная вирусология. Virology2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar] Остается выяснить, избавляются ли некоторые люди от инфекции или некоторые вирусные штаммы более устойчивы. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, существуют ли доказательства того, что SFV рекомбинируют в человеческих хозяевах, по аналогии с SIV / HIV, при котором рекомбинация между ретровирусными штаммами в новом хозяине была предвестником эволюции пандемических вирусов. Было проведено несколько исследований, чтобы определить, влияет ли концентрация SFV в слюне на передачу зоонозов, или как иммунный ответ человека способствует или предотвращает инфекцию или продолжающуюся виремию (Soliven et al. и Matsen et al., неопубликовано). И хотя данные, собранные в других географических регионах и других контекстах контактов человека с макаками, позволили понять, как демографические переменные, поведение макак и человека влияют на вероятность агрессии макак по отношению к человеку, относительно мало известно о том, как эти переменные влияют на ретровирус. передача. 18 Фуэнтес А., Гамерл С. Непропорциональное участие по возрастным / половым классам в агрессивных взаимодействиях между длиннохвостыми макаками (Macaca fascicularis) и туристами в обезьяньем лесу Падангтегал, Бали, Индонезия. Am J Primatol2005; 66: 197–204. [Crossref], [Google Scholar] Здесь мы представляем данные, описывающие воздействие на человека макак-резус и заражение SFV на нескольких объектах в Бангладеш и у владельцев обезьян. Большинство других исследований было сосредоточено на участке гена pol (интегразы), который является высококонсервативным и, следовательно, может не выявить вариации SFV, обнаруженные у инфицированных особей определенного вида. Мы получили несколько клонов из цельной крови и секвенировали часть гена gag SFV, выбранную по сравнению с pol, чтобы выявить большую генетическую изменчивость SFV, и использовали данные последовательности для сравнения вируса, обнаруженного у людей, с вирусом, обнаруженным у макак, с которыми они взаимодействуют. . Мы показываем, что люди могут одновременно инфицироваться несколькими штаммами SFV; некоторые люди инфицированы как автохтонным штаммом SFV (происхождение, где он был обнаружен), так и штаммом, аналогичным SFV, обнаруженным у макак из других географических регионов. Возраст был значительным фактором риска зоонозной передачи SFV людям. Женский пол и индуистская религия также могут быть связаны с повышенным риском. Эти данные в сочетании с нашими предыдущими результатами15 Фиероз М.М., Соливен К., Смолл К.Т. и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] предполагают, что перемещение макак при содействии человека, множественные инфекции SFV и рекомбинация ретровирусов вносят вклад в разнообразие ретровирусов в Бангладеш. сайтов (Силхет, Борми, Дхамрай, Нараянгандж и Чармагурия), а также 209 владельцев выступающих обезьян, принадлежащих к кочевой группе, которые устраивают представления с участием своих обученных макак. Общественные участки были созданы в 2007 году в местах, где макаки свободно обитают и жители которых были готовы участвовать в продольных исследованиях межвидовой передачи инфекционных агентов. Мы случайно отбирали успешных владельцев обезьян, когда сталкивались с ними по пути к нашим местам изучения сообщества или с них. Анализ разнообразия SFV среди обезьян из Бангладеш представлен в нашем сопутствующем исследовании.15 Фиероз М.М., Соливен К., Смолл С.Т. и др. Динамика численности макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Данные этого исследования также составляют часть набора данных SFV по макакам, исследованного в настоящем исследовании. Здесь мы представляем краткое описание полевых участков (рис. 1), включенных в это исследование. Зоонозный пенистый вирус обезьян в Бангладеш отражает различные модели передачи и коинфекции Все авторы: Грегори А. Энгель, Кристофер Т. Смолл, Хан Соливен, Мостафа М. Фиероз, Сяосин Ван, М. Камрул Хасан, Ганва О, С. М. Рабиул Алам, Карен Л. Крейг, Дана Л. Джексон, Фредерик А. Матсен IV, Максин Л. Линиал и Лиза Джонс-Энгель https://doi.org/10.1038/emi.2013.60 Опубликовано в Интернете: 25 января 2019 г. Рисунок 1 Места отбора проб и разнообразие штаммов SFV, обнаруженных у зоонозно инфицированных людей. Были опрошены и взяты образцы людей в пяти городских районах Бангладеш, где макаки-резус обитали на свободном выгуле. Недавно мы показали, что на каждом из этих участков у макак могут быть обнаружены основные штаммы SFV. 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CT и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Основные штаммы резус SFV обозначены на этой карте цветом. Для людей (обозначенных «BGH»), у которых было обнаружено, что они инфицированы SFV, мы получили несколько клонов из цельной крови и секвенировали часть гена gag SFV. Данные о последовательности были использованы для сравнения вируса, обнаруженного у людей, с вирусом, обнаруженным у макак с этого сайта. Цвет круга (ов) рядом с каждым из идентификаторов BGH означает штамм SFV, который был обнаружен у этих людей. Обратите внимание, что четверо из субъектов были одновременно инфицированы несколькими штаммами SFV и что некоторые люди инфицированы как автохтонным штаммом SFV (происхождение, где он был обнаружен), так и штаммом, аналогичным SFV, обнаруженному у макак из других географических областей. nks, источник неизвестен. Показать в полном размере Были опрошены и взяты образцы людей в пяти городских районах Бангладеш, где макаки-резус обитали на свободном выгуле. Недавно мы показали, что на каждом из этих участков у макак могут быть обнаружены основные штаммы SFV. 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CT и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Основные штаммы резус SFV обозначены на этой карте цветом. Для людей (обозначенных «BGH»), у которых было обнаружено, что они инфицированы SFV, мы получили несколько клонов из цельной крови и секвенировали часть гена gag SFV. Данные о последовательности были использованы для сравнения вируса, обнаруженного у людей, с вирусом, обнаруженным у макак с этого сайта. Цвет круга (ов) рядом с каждым из идентификаторов BGH означает штамм SFV, который был обнаружен у этих людей. Обратите внимание, что четверо из субъектов были одновременно инфицированы несколькими штаммами SFV и что некоторые люди инфицированы как автохтонным штаммом SFV (происхождение, где он был обнаружен), так и штаммом, аналогичным SFV, обнаруженному у макак из других географических областей. Силхет, расположенный в северо-восточной части страны, в пределах 35 км от границы с индийской провинцией Ассам, Силхет является третьим по величине городом Бангладеш. Популяция примерно 125 макак обитает в святилище Шах Джалал в центре города. Макаки Силхета обитают над святыней и в непосредственной близости от нее. Макаки Шах-Джалала регулярно кормятся персоналом святыни и часто получают пищу от посетителей святыни. В исследовании приняли участие четырнадцать человек, живущих недалеко от святыни. Борми В городе Борми, примерно в 50 км к северу от Дакки, по всей деревне обитает более 200 макак-резус, свободно перемещающихся между индуистскими и мусульманскими районами, часто заходя в дома в поисках. еды. Хотя некоторые жители Борми иногда предлагают макакам еду, организованного снабжения не существует. В этом исследовании приняли участие 105 человек из Борми. Город Дхамрай расположен в 40 км к юго-западу от Борми. Приблизительно 75–100 макак свободно распространяются по Дхамраю. Макаки предпочитают участки с большой тенью и плодоносящими деревьями, которые чаще встречаются в индуистских кварталах. Как и в Борми, здесь нет организованного кормления макак. В этот набор данных были включены девять субъектов из Дхамрая. Нараянгандж Нараянгандж - густонаселенный портовый город примерно в 20 км к югу от Дакки. Популяция макак резус в этой области продолжает сокращаться, поскольку городское развитие вытесняет зеленые насаждения. Примерно 60 макак в этом городе не имеют запасов и плохо приспособлены к людям. В исследовании приняли участие 150 человек из Нараянганджа. Чармагурия Чармагурия расположена в XNUMX км к югу / юго-западу от Дакки вдоль реки Падма. Более 200 макак в этом районе предоставлены местной организацией в центре города, а обильные зеленые зоны в этом небольшом городке представляют собой естественные коридоры, по которым животные широко распространяются. В исследовании приняли участие сорок пять человек из Чармагурии. Набор, информированное согласие и протоколы отбора проб, включая последующее наблюдение за SFV-положительными людьми, были одобрены Советом по обзору человеческих субъектов Вашингтонского университета (23055) и аналогичным наблюдательным советом в Университет Джахангирнагар, Бангладеш. Биологические и демографические данные о людях были закодированы с помощью уникальных анонимных идентификаторов, которые начинались с «BanGladesh Human» (BGH). На каждом объекте сообщества члены группы из Бангладеш установили контакт с руководителями районов и определили центральное место в пределах ареала макак для сбора данных. Затем члены группы из Бангладеш объединились с жителями общины и разошлись веером, прося участия людей, которые представились, что были укушены или ранены макаками. Критерии включения для субъектов включали возраст старше 18, самооценку воздействия NHP и / или долгосрочное (> 20 лет) проживание в деревне. Письменное информированное согласие было получено от всех субъектов. Демографические данные и данные, описывающие воздействие NHP, были получены с помощью анкеты, которую провел член группы на местном языке, бенгали. Десять миллилитров цельной крови было собрано из переднекубитальной вены каждого субъекта в пробирку, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту, которую хранили на льду не более 12 часов, а затем центрифугировали. Аликвоты цельной крови и плазмы хранили при -80 ° C до анализа. Стерильные омни мазки Whatman (Whatman, Piscataway, NJ, USA) использовались для взятия образцов слизистой оболочки рта. Тампоны немедленно помещали в 500 мкл Qiagen Buffer RLT (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), охлажденного на льду не более чем на 12 ч, а затем замораживали при -80 ° C до анализа. Эти методы в основном идентичны тем, которые мы использовали для сбора и хранения биологических образцов, полученных от макак. 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CT и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Повторный отбор образцов у людей с подтвержденным SFV-положительным результатом. Если у человека был подтвержден SFV-положительный результат с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), исследовательская группа попыталась связаться с ним и повторно взять образец примерно через 1 год после первоначального отбора образцов. . Протоколы сбора биологических образцов для последующего отбора образцов у субъектов, положительных по SFV, были такими же, как и при первоначальном отборе образцов. Кроме того, субъекты с положительной реакцией на SFV прошли краткий медицинский осмотр и был собран подробный медицинский анамнез. Взятие образцов макаки-резуса Наша сопутствующая рукопись для этого проекта15 Фиероз М.М., Соливен К., Смолл К.Т. и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] предоставляет все протоколы отбора проб животных и лабораторные протоколы. В настоящее исследование включены последовательности gag SFV от 184 макак-резус (рис. 2). Мы также включаем в этот набор данных последовательности, полученные из четырех резусов, двух из Дхамраи и двух из Борми, которые мы смогли повторить через два года после их первоначальной выборки. Зоонозный пенистый вирус обезьян в Бангладеш отражает различные модели передачи и коинфекции Все авторы: Грегори А. Энгель, Кристофер Т. Смолл, Хан Соливен, Мостафа М. Фиероз, Сяосин Ван, М. Камрул Хасан, Ганва О, С. М. Рабиул Алам, Карен Л. Крейг, Дана Л. Джексон, Фредерик А. Матсен IV, Максин Л. Линиал и Лиза Джонс-Энгель https://doi.org/10.1038/emi.2013.60 Опубликовано в Интернете: 25 января 2019 г. Рисунок 2 Классификация штаммов крови обезьян из выборочных популяций. Для каждой обезьяны цветная полоса, соответствующая выборке популяций обезьян, представлена ​​на (A), а цветные плитки, соответствующие штаммам, наблюдаемым в образце крови этой обезьяны, показаны на (B). Неосновные штаммы маркируются в соответствии с рекомбинантными отношениями, установленными с родительскими штаммами. Положительные совпадения определяются с вероятностью не менее 90% для 200 или более смежных пар оснований в анализе cBrother. Области генома, не совпадающие ни с одним родительским штаммом выше этого порога для по крайней мере 200 нуклеотидов, были помечены как nks (источник неизвестен). Это упрощенная версия рисунка из сопроводительного документа к этому исследованию, 15Feeroz MM, Soliven K, Small CT и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar], но с обновленными классификациями штаммов. Показать в полном размереРисунок 2 Классификация штаммов крови обезьян из выборочных популяций. Для каждой обезьяны цветная полоса, соответствующая выборке популяций обезьян, представлена ​​на (A), а цветные плитки, соответствующие штаммам, наблюдаемым в образце крови этой обезьяны, показаны на (B). Неосновные штаммы маркируются в соответствии с рекомбинантными отношениями, установленными с родительскими штаммами. Положительные совпадения определяются с вероятностью не менее 90% для 200 или более смежных пар оснований в анализе cBrother. Области генома, не совпадающие ни с одним родительским штаммом выше этого порога для по крайней мере 200 нуклеотидов, были помечены как nks (источник неизвестен). Это упрощенная версия рисунка из сопроводительного документа к этому исследованию, 15Feeroz MM, Soliven K, Small CT и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar], но с обновленной классификацией штаммов. Обнаружение S.FV Вестерн-блоттинг Линия клеток Telo-RF фибробластов макаки-резуса19 Кирхгоф В., Вонг С., Сент-Джонс, Пари Г. Создание линии клеток фибробластов макаки-резуса с увеличенной продолжительностью жизни для рост резус-радиновируса (RRV). Arch Virol, 2002; 147: 321–333. [Crossref], [Google Scholar] был заражен SFV M. mulatta или М. fascicularis, или оставленные незараженными. Через 48 ч клетки лизировали в 1 × буфере для пробы додецилсульфата натрия (50 мМ трис-HCl (pH 6.8), 10% глицерина, 2% додецилсульфата натрия, 5% 2-меркаптоэтанола, 0.01% бромфенолового синего) и пробы электролита. трофорезируется через 10% полиакриламидные гели. После переноса белков на мембраны из поливинилидендифторида (Millipore Billerica, MA, USA) мембраны блокировали фосфатно-солевым буфером + 0.05% твин-20, содержащим 2% обезжиренного сухого молока, промывали водой и оставляли сушиться. Были сделаны полоски, каждая из которых содержала три дорожки (маркер молекулярной массы, лизаты неинфицированных Telo-RF и инфицированных Telo-RF клеток), добавляли первичное антитело (человеческая плазма) в разведении 1-20 и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Полоски трижды промывали фосфатно-солевым буфером + 0.05% твин-20 перед добавлением вторичной козьей пероксидазы хрена против человека (Thermo Scientific и GE Healthcare Rochester, Нью-Йорк, США) в разведении 1-5000 в течение 1 ч при комнатной температуре. . Полоски промывали еще три раза перед ополаскиванием водой и нанесением стабилизированного 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидином субстрата для пероксидазы хрена (Promega Madision, WI, США) для визуализации полос. Плазма от BGH4, известного SFV-положительного человека 20 Джонс-Энгель Л., Мэй С.К., Энгель Г.А. и др. Разнообразные контексты зоонозной передачи пенистых вирусов обезьян в Азии. Emerg Infect Dis2008; 14: 1200–1208. [Crossref], [Google Scholar] использовался в качестве положительного контроля. Выделение ДНК из цельной крови Общая геномная ДНК была извлечена из цельной крови человека с использованием мини-набора QIAamp DNA blood mini (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Мы экстрагировали ДНК из 200 мкл цельной крови. Очищенную ДНК элюировали 200 мкл буфера AE. ПЦР-амплификация фрагментов gag и pol из геномной ДНК. Всего 15 мкл выделенной ДНК использовали для ПЦР-амплификации фрагментов gag или pol с помощью двухцикловой ПЦР. Первый раунд ПЦР представлял собой мультиплексную реакцию с праймерами gag и pol (последовательность праймера: G1 (+) (нуклеотиды 114–134, взяты из последовательности NC_1 NC_001364 SFV001736 GeneBank) 5'-AGG ATG GTG GGG ACC AGC TA-3 '; G2 (-) (нуклеотид 1451–1433) 5′-CAG GAA GAG GTA CTC GGG G-3 ′; P1 (+) (нуклеотид 5179–5200) 5′-GCC ACC CAA GGA AGT TAT GTG G-3 ′; P2 ( -) (нуклеотид 5768–5749) 5′-GCT GCC CCT TGG TCA GAG TG) -3 ′. Реакции денатурировали при 95 ° C в течение 3 минут, затем следовали два цикла 95 ° C в течение 30 с, 38 ° C в течение 1 минуты, 72 ° C в течение 1 минуты, затем следовали 25 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд. , 52 ° C в течение 1 мин и 72 ° C в течение 1 мин. Воду использовали в качестве отрицательного контроля. 2 мкл продукта ПЦР использовали в качестве матрицы для второго раунда ПЦР. Либо праймеры gag, либо pol (G3 (+) (нуклеотиды 190–212) 5'-CAA CCT AGA TGG AGA GCT GAA GG-3 '; G4 (-) (нуклеотиды 1425–1406) 5'-GGG GAC AAA CTA CGG CTG GG-3 '; P5 (+) (нуклеотиды 5339-5361) 5'-TAA TCC TCC AGG GTA TCC AAA A-3'; P6 (-) (нуклеотиды 5728-5707) 5'-ATA CCA TCG ACT ACT ACT ACA AGG A-3 ') использовали для амплификации отдельных фрагментов. Реакции денатурировали при 95 ° C в течение 3 минут, затем следовали 35 циклов при 95 ° C в течение 30 с, 52 ° C в течение 1 минуты и 72 ° C в течение 1 минуты. Ожидаемые размеры продуктов ПЦР для gag и pol составляют 1235 п.о. и 390 п.о. соответственно. Клонирование и секвенирование фрагментов gag. Продукты ПЦР FV очищали в геле с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Очищенные фрагменты лигировали в вектор клонирования TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и трансформировали в компетентные клетки Escherichia coli TOP10 (Invitrogen). Отбирали несколько одиночных колоний для каждого образца gag, очищали и секвенировали плазмидную ДНК. Секвенирование выполняли с использованием прямого и обратного праймеров M13, а также внутренних прямых и обратных праймеров для gag, разработанными Genomics Facility Вашингтонского университета или GeneWiz Inc. (Сиэтл, Вашингтон, США). Штаммы вирусов обозначаются строчными буквами, чтобы отличать их от географических участков, где отбирались образцы людей или макак (например, Дхамрай - это место исследования, где был обнаружен основной штамм дхамраи). Выделение РНК из буккальных мазков Замороженные образцы буккальных мазков в буфере RLT (Qiagen) размораживали при 37 ° C в течение 15 минут с 40 единицами ингибитора рибонуклеазы RNaseOUT (Invitrogen) и 1 единицами свободной от РНКазы ДНКазы I (Promega) непосредственно перед экстракцией РНК. Тотальную РНК экстрагировали согласно стандартному протоколу с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). РНК снова обрабатывали 40 ед. RNaseOUT и 1 ед. ДНКазы I, не содержащей РНКаз, при 37 ° C в течение 1 часа. Затем образцы инкубировали при 65 ° C в течение 15 минут для инактивации ферментов. РНК хранили при -20 ° C для последующего использования. ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) буккального мазка RNART-PCR выполняли для клонирования частичных gag-последовательностей (1235 п.н.) из РНК буккального мазка. КДНК первой цепи синтезировали с использованием системы Thermoscript RT-PCR (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя с использованием праймера Oligo (dT) 18. Реакции RT были инактивированы при 85 ° C в течение 5 мин. Полученные кДНК использовали в качестве матрицы для двух циклов ПЦР, как описано выше для амплификации gag FV цельной крови. Аналитические методы кластеризации и анализ гипермутации Последовательности, исследуемые в этом исследовании, продемонстрировали доказательства гипермутации, опосредованной APOBEC3. Подробный анализ этой деятельности представлен в Matsen et al. (Не опубликовано). Этот анализ произвел предположительно гипермутационное выравнивание отрицательной последовательности путем удаления столбцов, подозреваемых в гипермутации. Эти сопоставления использовались для оставшейся части анализа в этом исследовании, чтобы избежать объединения гипермутации и подлинного филогенетического сигнала. Филогенетические анализы Филогенетическое дерево было построено на основе предположительно свободного от гипермутаций сопоставления с использованием FastTree 2.1.7.21 Price MN.DPAAP FastTree: вычисление больших минимальных деревьев эволюции с профилями вместо матрицы расстояний. Мол, биол, эволюция, 2009; 26: 1641–1650. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar], 22Price MN, Dehal PS, Arkin AP.FastTree 2 - деревья приблизительно максимального правдоподобия для больших выравниваний. PLoS ONE2010; 5: e9490. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Это дерево было визуализировано с помощью Archeopteryx (https://sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx). Из того же выравнивания, SplitsTree 4.12.823Huson DH, Bryant D. Применение филогенетических сетей в эволюционных исследованиях. Мол, биол, эволюция, 2006; 23: 254–267. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] использовались для создания сети разбиения. Анализ цепей. Цепи были идентифицированы путем прохождения гипермутационно-отрицательного выравнивания с помощью итеративного алгоритма кластеризации с повторным центрированием. Было обнаружено, что однократное приложение UCLUST v1.124Edgar RC.Search и кластеризация на порядки быстрее, чем BLAST. Биоинформатика, 2010; 26: 2460–2461. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] дали плохие результаты кластеризации из-за жадной природы алгоритма. Был реализован итеративный алгоритм повторного центрирования, предложенный автором UCLUST на http://drive5.com/usearch/manual/recenter.html, который хорошо справился с этой проблемой. Для каждого раунда кластеризации согласованные последовательности из предыдущего раунда добавляли в верхнюю часть выравнивания без пропусков в порядке размера кластера от наибольшего к наименьшему. Для этой итерации кластеризация выполнялась с использованием cluster_smallmem, создавая новые согласованные последовательности и кластеры. Этот процесс повторялся дважды. Назначения кластеров дополнительно уточнялись с помощью сценария, который находил истинный центроид каждого кластера, как определено последовательностью с минимальным средним нормализованным расстоянием Хэмминга до каждой другой последовательности в кластере. Затем сценарий был проверен, чтобы убедиться, что каждая последовательность кластеризована с центром тяжести, к которому она ближе всего (опять же, как определено нормализованным расстоянием Хэмминга), при необходимости выполняя переназначения. Этот итерационный алгоритм применялся с использованием порога 97.77%. Этот порог, хотя и немного выше, чем тот, который использовался в нашем сопутствующем исследовании, 15Feeroz MM, Soliven K, Small CT и др. Динамика популяции макак-резусов и связанного с ними пенистого вируса в Бангладеш. Emerg Microbes Infect 2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] лучше отражает несколько меньшее количество разнообразия последовательностей в результате удаления столбцов, подозреваемых в гипермутации. Как упоминалось выше, вирусные штаммы обозначаются строчными буквами, чтобы отличать их от географических участков, где отбирались образцы людей или макак (например, Дхамрай - это исследовательский участок, где в первую очередь был обнаружен основной штамм дхамраи). Статистические методы Статистический анализ демографических переменных был проведен. выполняется с использованием пакета статистических программ JMP (Институт SAS, Кэри, Северная Каролина, США); Анализ таблиц непредвиденных обстоятельств проводился с помощью функции R fisher.test.25 R Core Team. R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений, 2012. [Google Scholar] РЕЗУЛЬТАТЫ Демографические данные, включая воздействие NHP За 5-летний период, 2007–2011 гг., Были собраны биологические пробы у 222 человек.

Оставить сообщение 

Список сообщений